条件性Trb2-Floxp基因敲除小鼠模型

Trb2 (tribbles pseudokinase 2)，即Trib2，编码的蛋白是tribe蛋白假激酶的一种，参与细胞凋亡、自身免疫、癌症、白血病和红细胞生成：在髓系细胞(THP-1)中受炎症的刺激表达上调；是一种致癌基因，包括黑色素瘤、卵巢癌、肺癌和肝癌；可灭活转录因子C/EBPalpha (CCAAT/增强剂结合蛋白)，并导致急性髓系白血病。研究报道，Trib2 基因敲除小鼠表现出大细胞贫血和T淋巴细胞增加，Trib2缺失主要影响了红细胞系的发育，而对骨髓中的粒细胞和巨核细胞系均无影响；Trib2在体内促进红细胞生成的作用并不依赖于C/ebpα蛋白，并对溶血耐受性至关重要。

F0代构建：采用Cas9进行基因定点敲入。

Trb2即Trib2，编码的蛋白是tribe蛋白假激酶的一种，是一种致癌基因，包括黑色素瘤、卵巢癌、肺癌和肝癌；可灭活转录因子C/EBPalpha (CCAAT/增强剂结合蛋白)，并导致急性髓系白血病。

动物模型的制备和应用实验必须在具备相应资质的实验室开展。动物模型的制备、应用过程中的监督管理、处置措施、对环境和生态影响等应符合国家相关法律规定。

为了研究Npsn在斑马鱼中性粒细胞中的功能，我们运用CRISPER/Cas9技术对斑马鱼npsn进行全基因组敲除，并且获得了一系列npsn基因发生移码突变的突变体斑马鱼，比如在exon5-Cas9靶点获得的（-7，+0）（npsnsmu5）突变体，和在exon6-Cas9靶点处获得的（-0，+1）（npsnsmu6）突变体，并且经预测它们的蛋白结构相对于野生型斑马鱼出现移码突变和提前终止。但是我们通过WISH检测发现在npsnsmu5突变体斑马鱼中，npsn的信号几乎是缺失的，并且qRT-PCR结果也同样证明了在npsnsmu5突变体中npsn的mRNA水平下降到野生型斑马鱼的5%左右，可能是由npsn的无义突变导致了mRNA的全面降解所导致的。但是npsnsmu5纯合突变体胚胎能够正常存活到成年，大小和体型正常，并且是可以正常的产生后代。

为了研究Npsn缺陷是否影响斑马鱼中性粒细胞的发育，我们通过斑马鱼中性粒细胞特异性标记基因mpx和lyz的整体原位杂交，发现npsnsmu5突变体和野生型斑马对比，mpx+和lyz+信号点的数量没有明显差别。苏丹黑染色也同样发现SB+阳性细胞的数量也没有差异。并且进一步在DIC下观察npsnsmu5突变体和野生型斑马鱼中性粒细胞中的颗粒，也未发现明显区别。以上结果表明，Npsn缺陷并不显著影响斑马鱼中性粒细胞的发育和数量。这可能是因为Npsn只是斑马鱼中性粒细胞中的一种酶颗粒，缺失后并不影响中性粒细胞的发育，但是可能影响了中性粒细胞的某些功能。

为了研究Npsn缺陷对斑马鱼中性粒细胞功能的影响，而中性粒细胞的主要功能是参与机体的固有免疫反应，因此我们做了斑马鱼大肠杆菌的侵染实验。我们利用显微注射的方式感染npsnsmu5突变体和野生型斑马鱼胚胎的卵黄囊，通过记录并比较感染后两者的生存率，发现npsnsmu5突变体在感染大肠杆菌后生存率相对于野生型胚胎显著下降，体内残余的菌量明显上升，并且在感染的早期阶段，npsnsmu5突变体中炎性因子的表达水平比野生型明显升高，这说明了中性粒细胞在抵抗细菌感染中存在功能缺陷。为了进一步验证Npsn在中性粒细胞抵抗感染中的作用，我们通过构建斑马鱼Npsn过表达的转基因系Tg(hsp:Myc-npsn)，并且同时感染大肠杆菌，发现Npsn过表达后能显著提高感染后斑马鱼的存活率。这个结果进一步表明，斑马鱼Npsn有助于斑马鱼抵抗细菌感染。

但是Npsn通过哪种方式来帮助中性粒细胞抵抗感染的呢？先前有体外实验证明，鲤鱼的Npsn能够水解纤连蛋白和明胶，而这两种组分又是细胞外基质的重要成分，那么Npsn是否通过影响斑马鱼中性粒细胞的迁移来影响对大肠杆菌的抵抗的呢？为了验证这个观点，我们观察了在感染后4小时时伤口处中性粒细胞的数量，但是比较npsnsmu5突变体和野生型斑马鱼并没有发现明显差异。另外，Npsn作为一种水解酶，它能否能够直接水解和破坏大肠杆菌细胞的完整性，进而影响大肠杆菌在机体内存活的呢？并且Npsn缺陷主要影响斑马鱼清除哪种类型的菌呢？为了验证这些问题，我们也将npsnsmu5突变体斑马鱼和野生型斑马鱼同时感染了其他类型的菌，如革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性菌铜绿假单胞菌等，发现Npsn缺陷后可能增加斑马鱼对革兰氏阴性菌的敏感性。但是Npsn影响斑马鱼中性粒细胞抵抗细菌感染的具体机制，还需要更多的实验来验证。另外npsnsmu5突变体可以作为斑马鱼免疫与炎症反应模型，对研究在感染过程中，中性粒细胞与病原菌的相互关系，以及对研发新的抗菌药物具有重要的指导意义。